1、学习m6A建库原理和分析流程时，关键步骤包括提取RNA并注意避免RNA降解，确保RNA质量满足特定标准。接着进行RNA打断片段化，富集m6A修饰的抗体进行IP文库构建，同时创建Input文库以对比分析。分析过程中，需要关注m6A修饰区域的Reads堆叠情况。此外，利用fastqc、multiqc、fastp等可视化软件进行数据质量的评估。
2、学习m6A建库原理及分析流程时，需关注实验环节，如RNA提取、建库测序等。确保RNA质量达标，提取时避免降解，检测RNA完整性。接下来进行IP文库和Input文库构建，并分析m6A修饰区域的Reads堆叠情况。数据质量可视化、过滤与比对至参考基因组是关键步骤，确保数据质量和准确性。
BWA 主要是将reads比对到大型基因组上，主要功能是：序列比对。首先为大型参考基因组建立索引，然后将reads比对到基因组。特点是快速、准确、省内存。由三种类似算法组成：BWA-backtrack，BWA-SW和BWA-MEM。首推BWA-MEM。BWA-backtrack：reads长度70bp时，推荐本算法，建议输入reads长度 100bp。
首先，了解序列数据文件，即FASTQ文件，它包含原始序列（reads）。FASTQ文件通过四行表示每个reads：第一行标识信息；第二行包含序列信息；第三行以+开头，与第四行的序列质量得分分开；第四行是质量得分。这些信息对于理解测序流程至关重要。在实际应用中，FASTQ文件通常作为其他工具的输入，而非直接分析。
序列比对是BSA-Seq分析的关键步骤，旨在将测序数据与参考基因组进行匹配。BWA等比对软件因其高效性被广泛应用，以解决海量测序数据的比对挑战。SNP Calling是基于贝叶斯定律进行的变异位点检测，通过对比对结果的分析，确定真实变异点的可能性。
BAM，全称为BAM文件，是SAM（Sequencing Alignment/Map Format）的压缩格式，最初由bwa软件输出，为解决原始SAM文件过大（如30x全基因组测序的sam文件可能超过600GB）的问题，通过高效的压缩算法，文件大小显著缩小。
据介绍，VarBen采用的是比对到参考基因组特定位点的测序reads进行编辑的方式来进行突变模拟，该方法可保留测序过程“湿实验”部分核酸提取、靶向捕获、文库制备以及测序过程中产生的错误分布模式，从而保证模拟数据更加的接近真实。
使用RNA-Seq数据很难发现除单碱基变异（SNV）之外的其他突变（比如Indel）。 要搞清楚这个read重复（duplicate）的问题，我想我们需要从NGS数据的产出过程说起，具体来说如下： 我们一般认为第1步DNA提取出来的是完整的基因组，打断则是完全随机的——通常来说也确实如此。
1、医院的NGS检测，即Next Generation Sequencing，是一种高级的胚胎植入前遗传学基因染色体筛查技术。它包括全基因组重测序（WGS）、全外显子组测序（WES）和目标区域测序（TRS），旨在快速精确地定位基因，提升试管婴儿的成功率。
2、基因测序技术（NGS）主要包括全基因组重测序、全外显子组测序和目标区域测序它们同属于新一代基因测序的范畴。NGS基因测序技术需要7~14天的时间才能出具检查报告，选择此项技术的前提是选择冻胚移植，即将培育出的囊胚进行冷冻处理，待到NGS检查结果出来后再进行囊胚移植。 NGS技术是筛查100多种基因。
3、该记录数获取的方法如下：htseq：htseq是NGS分析流程计算产生的counts值，是mapped到基因外显子区域的reads数目。RSEM：RSEM（RNA-Seq by Expectation-Maximization），考虑到一条read可能会匹配多个exon位置，故而其产生的为expected count。
